编者按：球孢子菌病为北美地区的地方流行性真菌病，近年来在我国可见输入性病例；临床上常常需要与肿瘤、结核等病变进行鉴别诊断。在近日举行的中华医学会第二次全国细菌真菌感染学术会议（BISC 2022）上，北京大学第一医院刘伟教授带来了“输入性球孢子菌病的病原学诊断及启示”的精彩报告。他在报告中分享了一例输入性球孢子菌病的诊治过程，在组织标本无法培养、且标本量非常有限的情况下采用新型技术进行病原学诊断，该病例报告的相关论文已发表在EMI杂志上。

 

 

01

一例输入性球孢子菌病的病原学诊断及启示

 

患者为63岁男性，主因“干咳、乏力6个月”就诊；CT示右肺下叶一 1.4×1.3×1.1 cm实性结节，双肺散在 0.1-0.2 cm毛玻璃样改变，常规实验室检查未见明显异常。一年前曾于墨西哥工作6个月，职业为矿工。

 

患者于本院行胸腔镜右下肺叶切除，组织病理显示：多发肉芽肿伴干酪样坏死，且散在的厚壁内孢囊含有内孢子，PAS和GMS染色阳性。

 

临床诊断为“肺球孢子菌病”；给予氟康唑（400 mg/日）治疗，共6个月。患者症状有显著缓解。

 

△胸部CT检查（上）和术后病理（下）

 

针对该输入性肺球孢子菌感染病例，刘伟教授提出以下问题：1）该病例具体感染的病原菌菌种是什么（粗球孢子菌 or 波萨达斯球孢子菌）？2）组织病理中的孢子是什么菌种，有可能是曲霉或其他真菌孢子吗？3）患者是否存在多种病原的合并感染？

 

对于仅有5片6μm的福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE）的非常有限的组织样本，二代测序（NGS）很可能难以构建文库。刘伟教授团队于是利用激光捕获显微切割技术（Laser capture microdissection，LCM）捕获组织切片中的PAS阳性的真菌成分（如菌丝和孢子），然后以真菌通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增；将获得的介于 500~750 bp 的扩增条带转化至大肠杆菌DH5α，然后将阳性克隆进行测序并作真菌菌种鉴定，结果显示所有阳性克隆中包含有链格孢属、曲霉属、枝孢属和镰刀菌属等，及球孢子菌属。为了进一步明确该患者感染的球孢子菌种，研究团队又采用球孢子菌特异性TaqMan探针进行实时PCR分析，结果显示含有粗球孢子菌（C.immitis）和波萨达斯球孢子菌（C.posadasii），但粗球孢子菌的扩增量（循环阈值/Ct为6）显著高于波萨达斯球孢子菌（Ct为30）。

 

△LCM捕获真菌成分（上）及孢子菌特异性TaqMan探针的扩增曲线（下）

 

刘伟教授团队已经于2021年在EMI杂志上发表了该病例报告，并复习了我国已报告的球孢子菌病病例相关的文献（Emerg Microbes Infect,2021 Dec）。由于临床表现和影像学检查缺乏特异性，大多数球孢子菌病患者容易被误诊为肿瘤或结核。该研究创新性地使用LCM和分子生物学技术在组织病理学阳性但无法培养的标本中鉴定出球孢子菌种，可为临床诊治提供借鉴。

 

 

刘伟教授指出，该病例的病原体确认过程采用的方法与高通量NGS检测在思路上其实“异曲同工”，包括从样本准备到测序和分析。临床上应该结合实际情况，在深刻理解不同检测技术的优缺点及临床标本的类型和标本量等因素的情况下，灵活使用不同的检测手段。此外，这例患者PCR检测中还检出链格孢属、曲霉属等其他真菌的克隆序列，应该如何判断这些真菌是否为真正的病原体？对于无菌部位和非无菌部位的标本如何检测、如何判定结果，面对无法培养的病原菌又该如何利用新技术精确检出病原体并作出正确的诊断？这些都是值得进一步深入探讨的问题。

 

02

一例下肢反复破溃患者的诊治思考

 

刘伟教授还分享了另一例病例。患者左下肢反复破溃2年余，曾使用利福平、异烟肼5月余，在用药期间仍有下肢溃疡自发出现；目前在口服头孢类抗生素，效果不佳。患者既往有类风湿关节炎（RA）病史多年，1年多来一直在使用来氟米特。

 

查体神清、体温正常；左小腿前内侧溃疡，表面黄色脓性分泌物，约4×5cm大小，暗红色边缘，界尚清；其下见指盖大小新发溃疡面；周围有散在萎缩性瘢痕，部分凹陷。

 

血常规未见明显异常，抗核抗体阴性。皮肤病理：表皮部分区域破溃，真皮至皮下脂肪弥漫中性粒细胞碎核伴组织坏死，可见散在多核组织细胞，未见明显病原体，PAS阴性；符合皮肤软组织感染。组织培养：真菌阴性、普通细菌及奴卡菌阴性。T-SPOT：混合淋巴细胞培养正常、干扰素测定正常。

 

△患者下肢皮肤病变外观及病理

 

刘伟教授指出该病例的特殊性：虽然病理显示符合软组织感染特点，但分枝杆菌检测阴性、抗结核治疗无效，组织培养为奴卡菌阴性、真菌阴性；从临床表现来看，不符合普通细菌感染，也可能由于应用来氟米特使感染的表现不够典型，后者具有抑制T细胞、B细胞激活和增殖等作用；此外，患者有RA病史多年，也需要考虑是否有坏疽性脓皮病等非感染性皮肤病的可能。

 

03

总　结

 

针对上述临床病例，刘伟教授总结道，尽管近来旅行和交流有所减少，但仍需注意输入性感染病增加的情况，在疾病诊治中需仔细询问患者的旅行史。其次，随着新型生物制剂及一些可能影响免疫功能的诊治技术的应用，包括小分子化合物JAK抑制剂、PD-1检查点抑制剂、CAR-T细胞疗法等，可能还会出现一些新的病原体及其感染。此外，二代测序技术及其他新型技术已开始在微生物及其感染的临床诊断中日益广泛应用，如何整合这些新技术、并在深入理解这些新技术的基本原理和优缺点的基础上在临床实践中加以合理利用，也是未来值得思考和重视的问题。

 

 

刘伟 教授

 

博士、教授，博士生导师、博士后合作导师

 

北京大学第一医院皮肤性病科、国家皮肤与免疫疾病临床医学研究中心、北京大学真菌和真菌病研究中心医师，皮肤病分子诊断北京市重点实验室副主任，北京大学第一医院—中国疾病预防控制中心传染病流行控制所“病原真菌联合实验室”主任，北京市西城区“预防艾滋病、梅毒、乙肝母婴传播工作专家组”成员，入选教育部“新世纪优秀人才支持计划”。

 

基于首先对曲霉耐药性研究揭示出新型耐药机制并建立检测新方法，揭示了临床重要病原性真菌的数种耐药新机制；首先提出我国病原性曲霉药敏试验判读流行病学折点；完成抗真菌新药的评价；鉴定两个抗真菌靶点；首先测序并注释希木龙念珠菌全基因组；揭示我国ICU念珠菌血症病原菌耐药机制；发现低温等离子体是抗真菌新手段；首先提出应警惕COVID-19感染的真菌感染。

 

欧美同学会医师协会理事，中国菌物学会理事、医学真菌学专委会副主委，中国微生物学会真菌学专委会副主委，欧洲临床微生物和感染性疾病学会（ECCMID）药敏委员会中国药敏专业委员会（ChiNAC）常务委员，中国医药教育协会真菌病专业委员会委员、副秘书长，中华医学会皮肤性病学会性病学组委员，中华医学会感染病学分会细菌与真菌学组委员。发表英文论文50余篇，授权专利4项。已指导6名博士和8名硕士。