编者按：CRISPR作为下一代分子诊断技术，凭借其高度的灵活性和精准性，在传染病检测、癌症早期诊断和遗传病识别等领域展现出了巨大的应用前景。本期“结核之窗”栏目分享了一篇近期发表于Nature Biomedical Engineering的科学研究，该研究系统揭示了首次证实传统RNA特异性核酸酶LbuCas13a可直接靶向DNA且无需PAM/PFS序列，其对DNA的单核苷酸特异性显著高于RNA。基于该特性，研究搭建了SUREST分子诊断平台。该平台可快速（25-40分钟）完成病毒检测（HPV16、HBV、新冠病毒等）、人类基因分型及0.1%低频变异筛查。该研究拓展了CRISPR-Cas系统的应用边界，为临床诊断提供了高效精准的新工具。

 

研究背景

 

CRISPR-Cas系统在基因编辑和诊断领域应用广泛，其中Cas13a传统上被认为是RNA特异性核酸酶，主要用于RNA检测，而Cas12a则靶向DNA。现有CRISPR诊断技术（CRISPR-Dx）虽能实现痕量核酸检测，但在单核苷酸多态性（SNP）鉴别特异性上存在挑战，且受限于原间隔序列邻近基序（PAM）或原间隔序列侧翼序列（PFS）约束，部分优化策略还存在脱靶效应或成本高等问题。

 

研究内容

 

（1）实验验证LbuCas13a的DNA靶向能力：通过体外实验构建LbuCas13a-crRNA复合物，测试其对单链DNA（ssDNA）、双链DNA（dsDNA）的结合与反式切割活性，排除关键组件验证特异性。

 

（2）优化检测条件：筛选最佳反应温度（33℃）和缓冲液（Bio-Lifesci buffer），结合重组酶聚合酶扩增（RPA）、PCR等技术增强检测灵敏度。

 

（3）搭建SUREST平台：整合LbuCas13a的DNA靶向特性与扩增技术，开发侧向流读数等_point-of-care testing（POCT）方法。

 

（4）临床与应用验证：检测人细小病毒B19、HPV16、乙肝病毒（HBV）、新冠病毒（SARS-CoV-2）及人类基因SNP（如CYP2C19 rs4986893），与SHERLOCK、DETECTR等平台对比。

 

结果

 

（1）LbuCas13a的新特性：突破传统认知，可直接靶向DNA（无需PAM/PFS序列），且不降解靶DNA，对DNA的单核苷酸特异性比RNA高19倍（ssDNA鉴别因子达98倍），归因于crRNA与DNA的结合亲和力更低。

 

（2）SUREST平台性能：检测灵敏度达0.3 aM（CYP2C19 rs4986893），可快速检测病毒（HPV16最低1 aM、HBV最低10 aM），区分新冠病毒野生型与Beta、Delta、Omicron变异株；在17例HBV临床样本和20例新冠临床样本中，检测结果与qPCR/RT-qPCR完全一致。

 

（3）基因型分析优势：成功区分人类基因三种基因型（野生型、杂合突变型、纯合突变型），对0.1%低频变异有效，检测时间仅25-40分钟，优于SHERLOCK（超2小时）和DETECTR（受PAM限制）。

 

研究解读和讨论

 

LbuCas13a的DNA靶向能力拓展了CRISPR系统的应用边界，其无需RNA转换步骤、不受PAM约束的特点，解决了传统CRISPR-Dx的核心痛点。SUREST平台将高特异性与高灵敏度结合，实现了“无损伤靶标、可重测、快速低成本”的检测需求，在病原体鉴定、基因突变分析等临床场景具有巨大潜力。此外，crRNA-DNA复合物的构象差异可能是特异性提升的关键机制，为后续CRISPR系统优化提供了新思路。

 

研究的局限

 

（1）LbuCas13a靶向DNA的分子机制尚未完全阐明，如双链DNA解旋的具体过程、蛋白质-核酸相互作用的结构基础仍需深入研究。

 

（2）实验中部分临床样本仅进行单次重复检测，可能受样本量限制影响结果稳定性。

 

（3）化学修饰crRNA等优化策略虽能提升性能，但因成本问题未在平台中应用，可能限制其部分场景的规模化推广。

 

结论

 

该研究首次发现LbuCas13a直接靶向DNA的特性，基于此开发的SUREST分子诊断平台，在单核苷酸特异性、检测灵敏度和适用性上显著优于现有技术。该平台无需PAM序列、无需RNA转换，可快速实现病毒检测、基因分型和低频变异筛查，为临床诊断提供了更高效、精准的工具，同时为CRISPR-Cas系统的功能拓展和机制研究开辟了新方向。

 

▌参考文献：

Xiaolong Wu，Siyuan Luo, et al. LbuCas13a directly targets DNA and elicits strong trans-cleavage activity. Nature Biomedical Engineering.Published 2025 Jun 20. doi:10.1038/s41551-025-01424-6

 

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卢水华 教授

教授，主任医师，二级教授，博士生导师

国家感染性疾病临床医学研究中心副主任，深圳市第三人民医院肺病医学部主任

担任：中华医学会结核病分会候任主委，世界卫生组织全球儿童和青少年结核病工作组成员，中国防痨协会学校与儿童结核病分会主委，上海市医学会结核病学分会荣誉主委，广东省医学会结核病学分会主委，第二届国家名医获得者，上海市十佳医师，国家十三五传染病重大专项负责人，国家自然基金重大课题负责人，国家卫健委流感医疗救治专家组成员，国家自然科学基金评审专家，国家药监局新药评审专家，国家药监局医疗器械评审专家，中华医学会医疗鉴定专家，多杂志副主编、编委及审稿专家

 

长期致力于TB的发病机制、疫苗与诊断技术开发、流行病学及新药临床试验等领域的研究：深入开展大规模人群队列研究，明确我国大学生人群Mtb感染率和BCG保护效率；构建和组织实施“结核感染免疫诊断分层解决方案”，牵头完成我国40年来首个结核I类新药（EC）的临床试验及上市；积极探索TB防控“关口前移”新策略，建立和推广结核潜伏感染早期筛查和精准干预体系；针对当前TB防治瓶颈问题，提出的“一体化综合防控策略”为“End TB”贡献了中国原创理论和技术产品体系。主持包括国家“十三五”传染病重大专项、重大新药创制项目、国家自然基金重大课题在内的国家、省部和市级科研项目11项，合计研究经费超7260万元。在NEJM、Lancet、PNAS等顶级期刊发表学术论文73篇，组织撰写指南与专家共识3篇，主编专著1部。相关成果获“中国防痨协会科学技术奖”一等奖和“上海医学科技奖”三等奖，多次被WHO指南引用

 

周雅娟

深圳市第三人民医院

2013年-2017年，安徽农业大学，茶学专业，本科

2017年-2024年，上海科技大学，微生物学专业，博士

Zhou Y, Liu X, Wu J, et al. CRISPR-Cas12a-Assisted Genome Editing in Amycolatopsis mediterranei[J]. Front Bioeng Biotechnol, 2020, 8: 698.·doi:10.3389/fbioe.2020.00698

 

来源：《感染医线》

 

声 明

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