编者按：侵袭性曲霉病是一种临床病死率高、早期诊断困难的侵袭性真菌病，欧洲癌症研究与治疗组织/真菌病研究组教育与研究联盟（EORTC/MSGERC）已将曲霉PCR纳入拟诊侵袭性曲霉病的微生物学诊断标准，但现有曲霉PCR检测存在泛曲霉法易交叉反应、种特异性法易漏诊、多重PCR成本高昂等缺陷。发表于Clinical Microbiology and Infection的研究设计并验证了一种新型多曲霉种逆转录定量PCR（Multi-Aspergillus species reverse transcriptase quantitative PCR, MAS-RTqPCR）。结果表明，MAS-RTqPCR是侵袭性曲霉病快速、精准、广谱诊断与疗效监测的理想工具，具备重要临床转化价值。

 

文献发表封图

 

侵袭性曲霉病是由曲霉属真菌侵入组织、血液引发的严重机会性感染，高发于造血干细胞移植、实体器官移植、长期糖皮质激素使用、中性粒细胞缺乏等免疫低下人群，早期症状隐匿、影像学不典型，漏诊与误诊率高，确诊延迟显著升高病死率。当前侵袭性曲霉病诊断依赖宿主因素、影像学、微生物学（培养、GM试验、PCR）与组织病理联合判断，其中分子诊断因快速、灵敏、无创的优势，成为突破侵袭性曲霉病诊断瓶颈的核心方向。

 

2019版EORTC/MSGERC侵袭性真菌病诊断共识明确，血液或支气管肺泡灌洗液中曲霉PCR阳性可作为拟诊侵袭性曲霉病的关键微生物学依据。但临床常用曲霉PCR方法仍存在明显局限：泛曲霉PCR靶向属保守序列，易与青霉属等近缘真菌交叉反应，导致假阳性；单一烟曲霉特异性qPCR灵敏度高，但无法覆盖黄曲霉、黑曲霉、土曲霉等致病种，易漏诊非烟曲霉感染；多重PCR需多探针并行，成本高且可能降低检测灵敏度。法国侵袭性真菌病监测数据显示，人类致病曲霉中超95%来自烟曲霉组、黄曲霉组、黑曲霉组、土曲霉组、构巢曲霉组、焦曲霉组，其中烟曲霉占74.4%，黄曲霉8.9%，其他非烟曲霉占比逐年上升，亟需一种兼顾广谱、特异、灵敏、经济的曲霉分子检测方法。

 

该研究采用诊断性病例对照研究设计，研发并优化了基于28S rRNA 靶点的多曲霉种逆转录定量 PCR（MAS-RTqPCR）；同时依托逆转录技术同步检测真菌DNA与RNA，以单探针完成烟曲霉组、黄曲霉组、黑曲霉组、土曲霉组、构巢曲霉组、焦曲霉组6个致病曲霉组的全核酸筛查，并结合组特异性引物实现分型鉴定。研究通过120例患者、223份血浆样本完成系统的分析性能与临床验证，为侵袭性曲霉病的精准诊断与动态监测提供新方案。

 

主要结果

 

（1）分析性能优异

 

检测限：烟曲霉为5拷贝/反应，黄曲霉为10拷贝/反应，LOD90达临床检测要求；

 

分析特异性：109株参考菌株验证中，仅靶向曲霉6个致病组，无非特异性扩增，特异性100%；

 

扩增效率：各曲霉种扩增效率均＞1.91，检测一致性良好。

 

（2）临床灵敏度显著优于传统qPCR

 

A组44份样本中，MAS-RTqPCR阳性率84.1%（37/44），Af-qPCR阳性率65.9%（29/44）；患者水平临床灵敏度：MAS-RTqPCR为0.91（95%CI：0.71~0.98，19/21），Af-qPCR为0.76（95%CI：0.55~0.89，16/21）。双阳性样本中，MAS-RTqPCR的Cq值显著低于Af-qPCR（P=0.0003）；且MAS-RTqPCR较仅检测DNA的MAS-qPCR Cq值更低（P=0.0048），证实检测RNA+DNA可显著提升灵敏度。

 

（3）临床特异性达100%

 

B组69份非侵袭性曲霉病样本均无扩增信号：55例高危无真菌病、5例镰刀菌病、4例毛霉病、5例组织胞浆菌病均为阴性，临床特异性1.00（95%CI：0.93~1.00），无交叉反应，排除近缘真菌干扰。

 

（4）纵向监测与非烟曲霉检出优势

 

C组30例患者中：

 

入组首日（D0）灵敏度：MAS-RTqPCR为30%（9/30），Af-qPCR为20%（6/30），MAS-RTqPCR更早检出阳性；

 

非烟曲霉检出：MAS-RTqPCR成功检出3例Af-qPCR阴性的非烟曲霉感染（黄曲霉组、黑曲霉组、构巢曲霉组各1例），弥补单一烟曲霉qPCR的漏诊缺陷；

 

动力学监测：75%（9/12）MASRTqPCR阳性患者在D0即检出阳性，高于Af-qPCR的46.2%（6/13），且在抗真菌治疗后仍可稳定监测核酸载量变化。

 

结论

 

本研究验证的MAS-RTqPCR是一种兼具高灵敏度、高特异性、广谱覆盖、低成本的新型曲霉分子诊断方法，检测限低至5拷贝/反应，临床灵敏度0.91、特异性1.00，可同步筛查6个致病曲霉组并完成分型，在侵袭性曲霉病早期诊断、非烟曲霉感染识别与抗真菌疗效动态监测中均优于传统烟曲霉特异性qPCR。该方法操作简便、适合临床常规开展，可有效弥补现有曲霉PCR技术的缺陷，为侵袭性曲霉病的精准诊疗提供全新解决方案，具备广阔的临床转化与应用前景。

 

▌原文链接：

Benazra M, Mallek W, Ghelfenstein-Ferreira T, et al. Clinical validation of a new multi-Aspergillus species reverse transcriptase quantitative PCR: a diagnostic case-control study. Clin Microbiol Infect. Published online March 28, 2026. doi:10.1016/j.cmi.2026.03.023

 

来源：《感染医线》

 

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